FSHW 老鸭瓣有效成分的提取及抗氧化活性研究

  老鸭瓣是百合科郁金香属的一种植物，又名迎春草，在早春发芽开花，是一种多年生草本植物，在我国主要分布于山东、安徽、江苏和浙江等地。并且其提取物中富有丰富的植物化学物质，报道较多的物质包括菲类化合物、简单芳香族化合物及其苷类、糖及糖苷类化合物和黄酮类化合物等，另外还含有生物碱、黄酮、多酚和其他生物活性物质，以及具有多种有益作用的多糖。有研究报道，老鸭瓣提取物中的单体或复合成分具有非常明显的降压、降脂和抗肿瘤作用。

  在生命活动过程中，机体会产生自由基，当自由基过量时就会对组织造成损伤，进而导致某些器官和组织的功能损伤，导致一系列疾病的发生。同时，在人体的衰老过程中，也会产生大量的自由基。氧化应激（Oxidative stress）是指在内外因素的刺激下，机体内氧化和抗氧化稳态失衡，活性氧（ROS）过度积累而引起的一系列生理生化应激反应。

  中南大学生命科学院张豆豆及何海伦教授 在本研究中对老鸭瓣的活性成分进行提取分析，并对其体外抗氧化能力进行测定。利用葡萄糖处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）构建氧化应激损伤模型，观察纯化产物能否抑制葡萄糖诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤，并利用转录组学分析其潜在的作用机制，为老鸭瓣的进一步开发应用和功能性食品的开发提供一定的研究基础和重要的理论依据。

  取不同质量浓度的水提粗提溶液，测定DPPH自由基清除活性，以VC（2 mg/mL）为阳性对照。根据结果得出（图2），随着样品浓度的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加。当样品初始浓度为5 mg/mL时，DPPH自由基清除活性为（79.08±2.39）%，并以DPPH自由基清除活性为参照准，对提取时间、温度和料液比来优化（图2B）。

  经凝胶过滤层析后，老鸭瓣水提物共得到5个分离组分，按出峰时间顺序命名为F1、F2、F3、F4、F5。将各成分样品浓度标准化为0.33 mg/mL，DPPH清除结果见图3B，相比之下，分离组分F2的DPPH自由基清除活性最高，清除率达到（72.86±1.64）%，明显高于其他组分，从而表明F2是最重要的抗氧化组分之一。将各分离组分的样品浓度标准化为0.2 mg/mL，结果见图3C。分离组分F2和F5的氧自由基清除活性均较高。当Trolox组的荧光值降为0时，F2和F5组的荧光强度依然较高，说明分离组分F2和F5均具有比较强的抗氧化作用。然后，对组分F2和F5进行浓度稀释，以确定氧自由基的吸收能力，如图3D和E所示。当样品浓度为0.1 mg/mL时，组分F2也具有比较强的抗氧化活性，对氧自由基的吸收能力达到（8.74±3.25）mmol TE/g，明显高于其他组分，表明F2是最重要的抗氧化组分之一。

  HUVEC细胞的损伤与许多血管疾病紧密关联，其中氧化应激是重要原因。保护HUVEC细胞免受氧化应激对预防和治疗血管疾病具备极其重大意义。采用MTT法测定纯化的抗氧化组分F2对HUVEC细胞活力的影响，没有观察到细胞毒性，表明纯化的部分F2是安全的，能够适用于ROS实验（图4A）。分别用无血清RPMI 1640培养基、含35 mmoL/L葡萄糖的无血清培养基、含35 mmoL/L葡萄糖的无血清培养基和不同浓度的样品处理细胞24 h，然后用ROS测定试剂盒检测各组细胞内ROS含量。如图4B和C所示，纯化组分F2处理的细胞荧光强度明显低于葡萄糖处理的模型组细胞，提示纯化组分F2能够清除细胞内ROS，保护HUVEC细胞免受葡萄糖引起的氧化损伤。纯化组分F2在50和100 µg/mL时具有较强的细胞内ROS清除活性，表明组分F2对葡萄糖诱导的HUVEC细胞氧化损伤具有保护作用。

  通过转录组分析，在对照和模型样品之间共检测到83个P＜0.05的差异表达基因，包括36个上调基因和47个下调基因；在对照和100 μg/mL样品之间共检测到403个P＜0.05的差异表达基因，包括114个上调基因和289个下调基因。进一步筛选发现如图5所示的3组差异表达基因，其中血红素加氧酶1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）与氧化应激紧密关联。Nrf2-ARE依赖的基因包括HO-1、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、NQO1、GSH等。这些基因与机体的抗氧化功能紧密关联，能发挥强大的ROS清除作用。同时，KEGG分析发现差异基因大多分布在在糖尿病和心血管疾病中，其中氧化代谢相关基因最多。

  为了进一步验证和研究老鸭瓣提取物的抗氧化功能，选取了两个差异表达基因及其相关基因进行qRT-PCR检测。经RNA提取、逆转录及qPCR验证（图6A-D），与对照组比较，模型组细胞中HO-1（HMOX1）、NQO1、GCLC表达下调，Nrf2表达变化不大。同时，与模型组相比，100 μg/mL F2处理的细胞中HO-1、GCLC和NQO1基因表达上调，但Nrf2的表达变化不大，有研究证明Nrf2活化后与Keap1解离并转运至细胞核，增加其在细胞核中的积累并与ARE结合，这也可能是其表达水平变化不明显的原因。然而，依赖Nrf2-ARE的下游基因HO-1、GCLC和NQO1显著上调。这与转录组结果一致。因此认为纯化的F2也作用于Nrf2/Keap1/ARE信号通路，抑制高糖诱导的HUVEC细胞氧化应激，见图6E。

  本文对老鸭瓣的活性成分进行了提取分析，并测定了其抗氧化能力。然后采用Sephadex LH-20凝胶对粗提物进行分离纯化，并测定纯化产物的抗氧化活性。利用HUVECs建立氧化应激模型，在细胞水平观察F2的抗氧化作用，并对相同处理的HUVECs进行转录组学分析，探讨F2组分保护HUVECs免受高糖诱导的氧化应激的可能机制。根据结果得出，组分F2具有比较强的抗氧化活性。此外，F2在HUVECs中表现出较强的抗氧化保护作用。同时，F2处理HUVEC细胞后，HO-1、GCLC和NQO1基因表达上调。本研究为提取物在食品和保健品中的进一步应用提供了依据。

  张豆豆，女，理学硕士，2020年毕业于中南大学生物化学与分子生物学系，主要研究方向为植物天然产物的提取及提取物的抗氧化活性作用，参与发表论文多篇。

  何海伦，女，中南大学生命科学学院教授，博士生导师。长期从事微生物酶结构和功能及生物资源酶解利用的相关研究。发表论文40余篇，作为主要参与作者的部分论文发表在J. Biol. Chem, Appl Environ Microbio等著名杂志上；论文被广泛引用，总他引数百余次。申请国家发明专利10项，授权发明专利10项。共主持或参与国家自然基金、863项目，省部课题20余项，这中间还包括主持国家自然基金2项，国家海洋公益项目1项，省级项目1项，教育部项目1项，中南大学“升华学者计划”人才基金1项。